摘要：动物消化道中栖息着数量庞大的微生物，肠道微生物在消化代谢及宿主免疫等方面发挥着诸多作用。肠道菌群稳态有赖于各种微生物的复杂作用，其对于维持宿主健康有重要意义，目前对于反刍动物消化道微生物的研究多聚焦于瘤胃微生物，反刍动物肠道微生物的研究较少且还处于较低水平。本文综述了反刍动物肠道菌群的组成及影响因素、潜在的功能以及肠道健康的调控，为反刍动物肠道菌群的研究提供参考。随着高通量测序技术的发展，胃肠道微生物对宿主健康的重要性被发现，而对于反刍动物，大量研究集中在瘤胃微生物群。瘤胃是反刍动物消化最主要的场所，但肠道微生物在消化过程也有着重要作用，而肠道菌群的研究仍较少。反刍动物消化道内建立稳定的共生菌群，可预防胃肠道感染并改善肠屏障功能，从而提高生产效率。本文归纳了反刍动物肠道微生物的相关研究，阐述了反刍动物肠道菌群的组成及影响因素、发挥的功能以及反刍动物肠道健康的调节，为肠道菌群在反刍动物生产和健康方面的研究提供参考。目前关于反刍动物肠道菌群结构的研究主要是基于不同种类、不同生长阶段不同生产性能的反刍动物，通过对其肠道内容物或粪便微生物测序分析探知肠道微生物的组成。一般认为奶牛粪便中优势微生物为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和柔膜菌门(Tenericutes)。研究发现，在刚出生且未进食的犊牛后肠道中，就已经存在高度多样的微生物菌群，且断奶前犊牛肠道微生物群以厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为主，类似于成年牛。虽然从出生犊牛肠道中就存在成年牛的主要微生物群落，不过肠道微生物定植是从不稳定的初始阶段到过渡阶段，并在各种因素影响下逐步向稳定的过程。研究发现，出生后1周的犊牛肠道黏膜上存在大量的大肠杆菌埃希-志贺菌属和沙门氏菌，在这一时期可能更容易受到致病菌侵袭。Ma 等也发现了类似的结果，在不同时间点饲喂初乳的新生犊牛于出生51h后采集的回肠和结肠样本中黏膜相关微生物主要是埃希-志贺菌属，且短链脂肪酸和回肠黏膜相关病原菌呈负相关，所以其推断短链脂肪酸可能是影响新生犊牛肠道健康的重要因素。另外，梅花鹿幼崽随着年龄的增加，其小肠内的埃希-志贺菌属呈下降趋势。这些研究在一定程度上说明了反刍动物在出生后容易受到致病菌侵袭，随着年龄增大，被致病菌感染的概率有所降低。 在不同种类的反刍动物中，虽然各菌群占比不同，但总体上均以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门为主，近几年在绵羊、牦牛、麋鹿等反刍动物上都得到了证实。总体来说，各部分肠段的微生物群落表现出特异性，且小肠内的菌群多样性和丰富度低于大肠。断奶前反刍动物的瘤胃并未发育成熟，在功能上通常认为类似于单胃动物的胃，而一些不可消化的营养物质便进入后肠发酵。犊牛后肠微生物定植对于断奶前犊牛的营养和能量的获取可能起着重要作用，另外黏附于黏膜表面和肠腔内与消化相关的菌群在一些菌属中有显著差异。研究发现断奶前犊牛后肠内参与氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢的细菌丰度不断增加，揭示了后肠菌群在这段时期对于发酵的重要性。但是断奶后犊牛粪便中与氨基酸和碳水化合物代谢相关的微生物显著减少，反映了营养代谢从下消化道向瘤胃发酵的转变。Wang等发现山羊小肠中能量、氨基酸、糖代谢相关基因非常丰富，且细菌的相对丰度与这些代谢功能明显相关。Wang等通过高通量测序技术对氮利用效率不同的山羊的肠道菌群进行测序，发现一些肠道微生物与氮素利用率正相关。通过微生物群功能预测，发现绵羊胃肠道中大多数代谢途径与碳水化合物代谢相关，这可能与数量丰富的拟杆菌门与厚壁菌门有关，因为它们是反刍动物胃肠道中的消化复杂碳水化合物的主要细菌。然而，有研究发现绵羊后肠中纤维素酶很少，大量的纤维素分解发生于胃肠道上部。 肠道黏膜免疫系统是脊椎动物最大的免疫器官，肠道菌群与肠道内环境之间的相互作用和动态平衡决定了黏膜免疫力和全身免疫力水平。一项临床研究表明，试验者服用益生元一定时间后其肠道菌群结构得到改善，粪便中的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量显著增加，并且肠系膜淋巴结和Peyer 结中各种促炎细胞因子表达量明显降低，说明肠道微生物种类和丰度影响肠黏膜免疫平衡。Malmuthuge等通过对新生犊牛小肠微生物组的分析，揭示了早期微生物对于肠道黏膜免疫反应的潜在影响。Sandes等从健康新生小牛中分离了7种可能的益生菌，并对其中几株菌进行体内免疫测定，发现它们能在无菌小鼠体内局部诱发sIgA的合成，并在系统水平刺激适应性免疫。肠道菌群可能与牛的饲料利用率相关，研究发现发现不同饲料效率的牛肠道菌群中毛螺菌科、瘤胃球菌科和普氏菌属存在差异，此外奶牛产犊前结肠微生物的组成与产犊后饲料效率的关系比瘤胃微生物要密切。Zhang等发现了乳蛋白的合成与Parabacteroides、Dorea和Sutterella 等氨基酸合成相关的微生物之间呈显著正相关，揭示了乳成分和肠道菌群之间的潜在联系。Li等还研究了泌乳高峰期的奶牛肠道微生物的多样性，而且短链脂肪酸产生菌可能会促进奶产量。反刍动物肠道菌群与其宿主健康状况密切相关。Gomez等采用高通量测序技术研究发现，腹泻犊牛的粪便菌群与健康犊牛差异显著，这导致腹泻犊牛肠道内与维生素、氨基酸和碳水化合物代谢有关的菌群相对丰度下降。Zeineldin等也发现腹泻犊牛粪便梭菌属、布劳特菌属、埃希氏杆菌属丰度增加，黄杆菌属、瘤胃球菌属、颤螺旋菌属和高温脱硫弧菌属相对丰度降低。Song等通过采集真胃移位奶牛的粪便样品进行高通量测序，发现患有真胃移位奶牛的粪便菌群多样性显著低于正常奶牛。此外还有研究发现，泌乳期奶牛瘤胃菌群多样性与牛奶体细胞数相关，这提示我们奶牛肠道微生物与奶牛乳房炎之间有潜在联系。Ma等发现了患有乳腺炎奶牛的牛奶和粪便微生物组成的巨大差异，并将这种变化与肠道乳杆菌联系起来。将患有乳房炎奶牛的粪便转移到无菌鼠体内，发现小鼠同样出现了乳房炎症状，此试验进一步证明了肠道菌群失调可能是引起奶牛乳房炎的原因之一。牛是大肠杆菌O157：H7的主要宿主，农场内有些牛排出的粪便中O157：H7含量>104CFU，被称为超级脱落，会造成大肠杆菌在农场内传播。Wang等研究发现人后肠内某些特定菌群可以增强宿主免疫系统和肠道屏障，进而减少大肠杆菌O157：H7的生长和定植，为控制这种病原菌提供了新策略。此外，乳酸菌还有可能通过改善肠道菌群的结构来减少反刍动物甲烷的排放，但是目前的研究比较少，缺乏权威性的研究结果，如果能找到这种乳酸菌并把它应用为饲料添加剂，将会给畜牧业可持续发展作出重要贡献。日粮的变化--营养成分和饲料形态等可以显著改变肠道微生物群落。一项关于四川羚牛的研究发现，与野生羚牛相比，圈养羚牛的肠道菌群有更高的群落多样性，且圈养羚牛个体之间没有明显差异，提示日粮可能是影响菌群结构差异的一个重要原因。此外，有研究发现给山羊饲喂高精料可以增加回肠内与蛋白质和碳水化合物降解相关的菌群，改变肠道菌群结构，诱导肠道菌群及其代谢紊乱，增加肠道炎症的风险。在羊驼中也发现了不同饮食条件下，消化道的不同部位存在独特的微生物群。在饲粮中添加益生元能特异性改变肠道菌群组成，Castro等发现饲喂半乳糖会增加新生犊牛肠道中乳酸菌和双歧杆菌的相对丰度。 Ji 等研究发现泌乳奶牛肌肉注射抗生素3d或14d均能引起肠道微生物群显著下降，且这种下降在停用抗生素后仍能持续18d以上，说明停药后菌群恢复需要较长时间，另外菌群移植可以促进肠道菌群的恢复。Holman等给新生犊牛注射土拉霉素，发现注射抗生素2d后有27个OTU丰度显著降低，注射后34d只有个OTU丰度发生改变，这意味随着时间的延长，抗生素对犊牛粪便微生物菌群影响减少，肠道菌群逐渐恢复稳态。肠道菌群随着年龄的增长会发生变化，这一变化主要发生在未成年时期，肠道菌群随年龄的增加一般逐渐定植并相对稳定存在。研究发现新生犊牛在前6周小肠内细菌群落多样性和丰富度不断增加。梅花鹿幼崽小肠微生物定植从出生到断奶也在不断增加。另一项研究发现梅花鹿瘤胃和盲肠内菌群在断奶前后有明显的区别，然而瘤胃和盲肠中主要的产甲烷菌没有随着年龄增长而变化。Uyeno等研究发现犊牛出生后的12周内随着消化道不断代谢与发育，其肠道菌群落发生了动态变化。随年龄增加微生物逐步在肠道中定植，肠道菌群多样性和稳定性增加，最终成熟，这个过程在人上需要约3年时间，奶牛大约需要4.5个月。 有研究发现，去角和阉割引起犊牛应激反应显著降低犊牛的胃肠道微生物多样性。一项关于腹泻牦牛和健康牦牛肠道菌群的研究发现了真菌多样性的显著差异。Plaizier等发现亚急性瘤胃酸中毒也会对肠道细菌造成影响。Bach等对奶牛产前产后21d的瘤胃和结肠微生物进行了分析，发现奶牛产后结肠微生物多样性下降，且至少在产后21d仍保持在一个较低的状态。研究发现，延迟初乳喂养会影响肠道黏膜相关菌群，犊牛出生后12h饲喂母乳，其结肠黏膜相关的乳杆菌属(Lactobacillus)明显比45 min 和 6h饲喂母乳的犊牛低，且肠球菌属(Enterococcus)和链球菌属(Streptococcus)也会增多，很可能对牛的肠道健康造成影响。宿主所处环境也可以影响到宿主肠道菌群。Wong等发现，当果蝇暴露于特定环境中可以人为塑造其肠道微生物。Zhang等通过研究对比高低海拔三河牛粪便菌群结构和代谢发现，海拔高度显著影响了三河牛肠道菌群结构组成和代谢物的产生。提示反刍动物通过调整肠道菌群结构适应高海拔的极端环境，具体作用机制还需进一步研究。由以上可知，除了日粮、年龄和环境会影响肠道微生物群落，药物、异常的生理状态下肠道微生物的结构也会改变，一些刺激也会对肠道稳态造成不利影响，这些研究结果可以为反刍动物饲养提供一些帮助。肠道菌群作为机体的第二大基因组，它的结构和稳态对于宿主的肠道及机体健康有十分重要的作用，因此通过营养添加剂改善肠道菌群也被广泛研究，找到一种营养素或饲喂策略对于肠道健康是十分重要的。 Delsuc 等指出，动物基因型影响消化道微生物，但主要驱动力仍然是食物种类。Lin等认为日粮调控可以通过改变奶牛肠道中的BA转化途径,进一步调控肠道微生物群从而改善宿主健康。Green 等认为，日粮对肠道菌群的调控作用已被广泛证实，这种调控对机体的益处或危害还难以证实，因此亟需深入研究靶向调控菌群的日粮。断奶前在犊牛饲粮中添加鼠李糖乳杆菌可以调节胃肠道微生物平衡，提高采食量和生长性能。Fomenky等探讨了在断奶前犊牛日粮中分别添加酿酒酵母、嗜酸乳杆菌对肠道菌群的影响，发现它们显著影响断奶前肠道细菌群落结构但是对多样性影响较小，且这两种菌分别可以显著降低某些潜在致病菌的数量，增加某些益生菌的数量。Ma等研究发现向山羊日粮中分别和组合添加酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌，对于奶产量和乳成分表现出了各自的积极作用，而肠道菌群的丰富度和多样性没有显著变化，但是某些菌群发生了变化，埃希-志贺菌和克里斯滕森菌科显著减少，琥珀酸弧菌科增多，对肠道微生态有积极作用。研究发现解淀粉芽孢杆菌应用于犊牛可表现出对肠道致病菌的抗菌和杀菌活性。从牦牛中分离出来的假肠膜明串珠菌和约氏乳杆菌可以显著缓解肠侵袭性大肠杆菌诱导的肠道菌群失调，增加有益菌数，减少有害菌数，改善了肠侵袭性大肠杆菌引起的相关腹泻。Ma 等研究发现在向无菌小鼠移植患有乳房炎的奶牛粪便微生物时同时添加益生菌干酪乳杆菌，可以显著恢复小鼠的乳房炎症状，这可能是通过剌激宿主免疫系统和改变肠道微生物的组成实现的。Izuddin 等研究发现在断奶羊羔日粮中添加0.9%的植物乳杆菌代谢产物，促进了瘤胃乳头的生长，减少了肠道内的病原体数目，提高了肠道黏膜屏障的完整性和肠道免疫功能。在断奶前犊牛日粮中添加酿酒酵母发酵产物也发现改善了犊牛的胃肠道形态，且添加1%的效果明显比添加0.5%好，并推测可能是由于添加发酵产物导致的微生物变化增加了瘤胃内丁酸盐的浓度。丁酸作为一种微生物代谢产物，在动物肠道健康中发挥着重要作用。在断奶前犊牛饲粮中添加不被保护的丁酸盐可以促进胃肠道的发育，提高生长性能，而且断奶后补充可以提高固体饲料的采食量，但是补充丁酸盐的形式、来源以及适宜的添加量还未确定。 菌群移植是指将供体消化道内微生物群落移植到受体消化道内的技术手段。Pounden 等最早发现瘤胃液移植降低了犊牛腹泻率，提高了犊牛存活率。Huang等通过产后奶牛瘤胃液移植发现瘤胃菌群移植改变了粪便微生物群的组成并调节了微生物代谢途径，这对于制定和安全评估瘤胃微生物干预策略至关重要。反刍动物肠道微生物的组成受多方面因素的影响，且与营养代谢、生产性能以及健康状况有密切联系，通过益生菌或其代谢产物等益生物质可以调控肠道微生物的稳态，促进反刍动物的健康。目前对于反刍动物消化道菌群的研究主要集中在瘤胃微生物，而对反刍动物后肠道的研究(包括但不限于不同种类、不同生产性能的反刍动物的组成及影响因素)较少。因此，对于反刍动物肠道微生物的具体功能和机制还需要进一步研究，为改善反刍动物肠道稳态、营养干预、疾病发生以及生产效率等提供参考。作者：张新雨，李胜利2023年9月28网络首发于《中国畜牧杂志》
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